酵母双杂交一对一互作检测

一．实验原理：

酵母双杂交系统是在酵母体内通过重建有活性转录因子的结构来鉴定蛋白质之间的相互作用。转录因子可以和DNA上特异的序列结合而启动相应基因的转录。这种DNA结合与转录激活的功能是由转录因子上两个相互独立的结构域即DNA结合结构域(Binding Domain, BD)和转录激活结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录激活都是必须的。在GAL4系统中利用转录因子GAL4的DNA结合结构域GAL4-BD与激活结构域GAL4-AD的特异载体，分别与基因的ORFs融合，转化酵母细胞。在酵母内表达的蛋白若发生相互作用时，就会将GAL4-BD和GAL4-AD结合在一起，从而与上游激活序列(upstream activating sequence, UAS)结合，激活相应报告基因的表达，在相应的营养缺陷型培养基上筛选阳性。

一般情况下，单独的BD蛋白可以与GAL4上游活化序列结合，但不能引起转录。然而，将一段具有转录激活活性的转录因子构建到BD载体上，若其表达产生的BD蛋白单独有UAS结合也可以引起下游报告基因的转录，那么就称之为酵母双杂交的自激活现象。反过来，可以利用这种自激活现象来验证某个转录因子是否具有转录激活活性。

二．试剂及仪器：

Library Construction & Screening Kits (Clontech, Cat. No. 630490)

YNB (Yeast nitrogen base without amino acids),(DIFCO, lot: 2282593)

Yeast extract (OXOID, LP0021)

amino acids（Bio sharp，America）

Peptone (OXOID, LP0042)

Glucose （国药，lot:10010518）

Agar (武汉创新生物,lot: BM0212)

Trizol (Invitrogen)

PCR仪(ABI, 9700)

冷冻离心机 

玻璃平皿及刮铲 

恒温生长箱 

恒温摇床 

2L三角瓶 

500ml、50ml、10ml、1.5ml离心管

三．实验步骤：

1. 载体构建：构建pGADT7和PGBKT7载体。

2. 准备酵母感受态细胞（LiAc Method） 

1). 从YPDA平板挑取AH109单菌落接种于YPDA液体培养基4 ml，30℃，225 rpm，振荡培养18-20 h（过夜），至OD600>1.5，一般为4左右。

2). 转接YPDA液体培养基，培养体积为50 ml，使初始OD600=0.2，30℃，225 rpm，振荡培养4-5 h，至OD600=0.6。

3). 离心收菌，室温，4,000 rpm，5 min。

4). 用20 ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4,000 rpm，5 min，弃上清。

5). 用5 ml 0.1 M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4,000 rpm，5 min，弃上清。

6). 用500 ul 0.1 M LiAc重悬菌体，混匀，分装至1.5 ml离心管，每个50 ul（每个转化），备用。

7). 每个1.5 ml离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1 min左右，至完全混匀。

6). 30℃水浴孵育，30 min。

7). 42℃水浴热激，25 min。

8). 30℃水浴复苏，30 min。

9). 离心收菌，室温，4,000 rpm，5 min，弃上清。

10). 每个转化用200 ul无菌水悬浮菌体，尽量温和地混匀，涂布相应的缺陷型筛选平板。

11). 30℃恒温培养4天。

3．x-gal检测实验

x-gal检测原理：X-α-Gal检测酵母MEL1基因的激活，MEL1是GAL4酵母双杂交系统的一个报告基因，编码分泌型的α-半乳糖苷酶。该酶可水解无色的X-α-Gal底物并最终产生蓝色产物。表达α-半乳糖苷酶的酵母菌落在含有X-α-Gal的培养基上显蓝色，即阳性的双杂交作用。

操作方法：将四缺SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp平皿上的克隆转接到新的含有X-α-Gal的选择性四缺培养基上，培养2-4天，如果克隆变蓝，说明蛋白有互作，否则，克隆则为假阳性。

四．实验结果：

1. 检测实验分组

2. 检测结果

酵母双杂交结果显示所有共转BD和AD载体的AH109菌株在二缺培养基上都长出了克隆，说明共转化成功；将SD/–Leu/–Trp培养基上的克隆挑取至SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp平皿中培养发现：

pGADT7空载体与pGBKT7-bait-1的共转化菌落在SD-TLHA板上能能生长并使菌落显蓝色，表明pGBKT7-bait-1存在自激活。由于bait-1存在自激活，所以无法判断是否与prey-1和prey-2是否存在相互作用。其余各组无自激活也无相互作用。

自激活检测

相互作用检测

图注：本实验是通过共转化酵母菌AH109并经过选择性培养基筛选完成的。

附：培养基

2×YPDA

Yeast extract                    5 g

Peptone                       10 g

Glucose                       11 g

adenine hemisulphate25 mg

Add ddH2O to                     250 ml

agar (add for solid medium)     5g ∕ 250 ml

SC/-Trp(SC-1)

Yeast nitrogen base         1.675 g

-Trp DO                     0.17 g

Glucose                     5.5 g

Add ddH2O to                   250 ml

agar (add for solid medium)5g ∕ 250 ml

SC/-Trp-Leu(SC-2)

Yeast nitrogen base         1.675 g

-leu/-trp DO                 0.17 g

Glucose                     5.5 g

Add ddH2O to                  250 ml

agar (add for solid medium)5g ∕ 250 ml

SC/–His/–Leu/–Trp（SC-3）

Yeast nitrogen base         1.675 g

–His/–Leu/–Trp DO       0.17 g

Glucose                     5.5 g

Add ddH2O to                  250 ml

agar (add for solid medium)5g ∕ 250 ml