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膜体系文库筛选点击次数：
发布时间：2022-12-23 12:14:37 |
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筛选膜蛋白酵母双杂交文库
实验进展报告
目的：
发现XXX相互作用蛋白
方法：
以XXX基因cDNA为诱饵构建膜酵母双杂交诱饵载体，筛选膜酵母双杂交XXX cDNA文库，经过对阳性克隆的多重报告基因检测、DNA测序和BLAST比对分析，确定与XXX相互作用的蛋白。
材料：
1．诱饵克隆：pBT3SUC-XXX
2．诱饵载体：pBT3SUC
3．文库质粒：pPR3N-XXX
4．膜蛋白酵母双杂交系统（DUALmembrane starter kit）
5．培养基：
1). 大肠杆菌培养基：
LB：0.5% Yeast extract，1% Polypeptone，1% NaCl, pH至7.0。
LBA：含有ampicillin （100 ug/mL）的LB培养基。
LBK：含有kanamycin（50 ug/mL）的LB培养基。
2). 酵母完全培养基：
YPDA：1% Yeast extract，2% Tryptone，2% Glucose, 0.02% Adenine。
3). 酵母营养缺陷型筛选培养基：
参照DUALsystem公司的DUALmembrane starter kits User Manual。其中各种培养基分别以下列符号表示：
SD-L：-leu；SD-T：-trp；SD-H：-his；SD-A：-ade；SD-U：-ura；
SD-TL：-trp, -leu；SD-TLH：-trp, -leu, -his；SD-TLHA：-trp, -leu,-his, -ade。
第一部分 诱饵载体构建
为将XXX基因cDNA克隆构建到膜蛋白酵母双杂交的诱饵载体上，需对含有目的基因的载体进行扩增、Sfi I酶切，获得该克隆片段，并与Sfi I酶切的膜蛋白酵母双杂交诱饵载体质粒pBT3SUC载体连接。
1.1 引物合成
根据XXX基因的cDNA序列分别在其两端添加Sfi I的酶切位点序列设计引物，用于扩增XXX基因的cDNA片段，引物序列如下：
XXX-F：aaGGCCATTACGGCCTGACCACAGACGGTGTTCT
XXX-R：ccGGCCGAGGCGGCCCCCTGTTGACTAGAATGAACAGGGAAT
CTCTCGAGAAC
1.2 目的基因扩增
用于扩增目的片段的热聚合酶：全式金TransStart FastPfu DNA Polymerase
PCR扩增体系：50 ul体系 | PCR扩增条件 | |||
Template DNA | 1 ul | ① 98℃ | 5 min | |
XXX-F (10 uM) | 1 ul | ② 98℃ | 30 sec | |
XXX-R (10 uM) | 1 u | ③ 55℃ | 30 sec | |
5×buffer | 10 ul | ④ 72℃ | 20 sec | |
dNTP mixture (10 mM) | 1 ul | ②-④ | 35 cycles | |
FastPfu DNA Polymerase | 1 ul | ⑤ 72℃ | 5 min | |
ddH2O | Up to 50 ul | ⑥ 4℃ | Forever | |
1.3 XXX与诱饵载体pBT3SUC-XXX的酶切和连接
用于片段和载体酶切的试剂：Sfi I（NEB公司)
用于酶切产物回收的试剂：胶回收试剂盒（Axygen公司）
用于片段和载体连接的试剂：DNA Ligation Kit （TOYOBO 公司）
酶切和连接反应体系：
片段XXX 25ul酶切反应体系 | 载体质粒 /pBT3SUC 20ul酶切反应体系 | Ligation High 10ul连接体系 | ||||
片段XXX | 20 ul | 载体质粒 | 10 ul | Ligation High Buffer | 5 ul | |
Sfi I | 2 ul | Sfi I | 1 ul | 片段XXX/Sfi I | 5 ul | |
10×buffer | 2.5 ul | 10×buffer | 2 ul | pBT3SUC-XXX/Sfi I | 0.5 ul | |
ddH2O | 0.5 ul | ddH2O | 7 ul |
Ligation High反应条件： 16℃ 1 h | ||
Sfi I反应条件：50℃过夜 | ||||||
1.4 连接产物转化大肠杆菌Top10
1). 向连接反应体系中加入100 ul大肠杆菌Top10感受态，冰浴30 min。
2). 42℃水浴热激90 sec（45 sec - 2 min）。
3). 冰浴2 min。
4). 加入900 ul LB液体培养基，37℃，150 rpm，孵育1 h。
5). 离心收菌，4,000 rpm，3 min，弃上层上清，留约100 ul混匀后涂布LBK平板。
6). 37℃，恒温培养过夜。
结果：经DNA测序检查，插入片段序列正确，可进行后续实验。
第二部分 XXX自激活检测和功能检测
2.1 酵母转化反应
将各种质粒组合转入受体菌NMY51中，观察检测结果。
Reaction | AD plasmid | BD plasmid | 涂板种类 | 备注 |
1 | pNubG-Fe65 | pTSU2-APP | SD-TL、SD-TLH、SD-TLHA | 阳性对照 |
2 | pPR3N | pTSU2-APP | SD-TL、SD-TLH、SD-TLHA | 阴性对照 |
3 | pPR3N | pBT3SUC-XXX | SD-TL、SD-TLH、SD-TLHA | 自激活检测 |
4 | pOST1-NubI | pBT3SUC-XXX | SD-TL、SD-TLH、SD-TLHA | 功能检测 |
5 | ———— | pBT3SUC-XXX | SD-L | 筛库备用 |
2.2 酵母转化方法
1). 从YPDA平板挑取NMY51单菌落接种于YPDA液体培养基4 ml，30℃，225 rpm，振荡培养18-20 h（过夜），至OD600>1.5，一般为4左右。
2).转接YPDA液体培养基，培养体积为50 ml，使初始OD600= 0.2，30℃，225 rpm，振荡培养4-5 h，至OD600= 0.6。
3).离心收菌，室温，4000 rpm，5 min。
4).用20 ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。
5). 用5 ml 0.1 M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。
6).用500 ul 0.1 M LiAc重悬菌体，混匀，分装至1.5 ml离心管，每个50 ul（一个转化），备用。
7).每个1.5 ml离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1 min左右，至完全混匀。
50%PEG3350 | 1 M LiAc | ssDNA(20 mg/ml) | 质粒DNA |
240 ul | 36 ul | 5 ul | 各5 ul |
8). 30℃水浴孵育，30 min。
9). 42℃水浴热激，25 min。
10). 30℃水浴复苏，30 min。
11). 离心收菌，室温，4,000 rpm，5 min，弃上清。
12). 每个转化用300 ul无菌水悬浮菌体，尽量温和地混匀，涂布相应的缺陷型筛选平板。
13). 30℃恒温培养4天。
2.3 XXX自激活检测及功能检测结果
在膜蛋白酵母双杂交系统的在阳性对照的反应1中，因为APP-bait和Fe65-prey具有强相互作用，可在SD-TLH和SD-TLHA筛选平板上生长旺盛。而在阴性对照的反应2中，因APP-bait与prey空载体之间没有蛋白相互作用，所以在SD-TLH和SD-TLHA筛选平板上的应该没有菌落生长或显著少于阳性对照。在自激活检测（反应3、4）中，SD-TLH和SD-TLHA筛选平板上应观察不到显著的生长。在功能检测（反应5、6）中，如果诱饵蛋白在酵母细胞内具有表达功能，便会依据诱饵蛋白的表达水平高低不同，而在SD-TLH和SD-TLHA的筛选平板上有10%-100%的生长率。
酵母转化后培养4天，记录每块平板上的克隆数，并计算每个转化反应在缺陷平板上的转化子数量和生长率。
反应 | 1 | 2 | 3 | 4 |
SD-TL | 2338 | 1788 | 2876 | 2798 |
SD-TLH | 1886 | 0 | 0 | 2512 |
%growth on SD-TLH | 80.6% | 0% | 0% | 89.7 % |
SD-TLHA | 1764 | 0 | 0 | 2424 |
%growth on SD-TLHA | 75.4% | 0% | 0% | 86.6% |
备注 | 阳性 对照 | 阴性 对照 | 无 激活 | 有 功能 |
第三部分 文库筛选
用含有正确pBT3SUC-XXX诱饵质粒的NMY51酵母转化子作为受体菌制备感受态，将pPR3N-XXX 文库质粒转入其中，涂SD-Trp-Leu-His+5 mM 3AT平板。
3.1文库DNA转化方法：
1). 从SD-L平板挑取单克隆菌种接于液体SD-L培养基50 ml，30℃，225 rpm，振荡培养18 h。
2). 转接于YPDA液体500 ml，使初始OD600= 0.2，30℃，225 rpm，振荡培养4-5 h，至OD600= 0.6。
3). 离心收菌，室温，4,000 rpm，5 min。
4). 用30 ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4,000 rpm，5 min，弃上清。
5). 用20 ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4,000 rpm，5 min，弃上清。
6). 用10 ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4,000 rpm ，5 min，弃上清。
7). 向离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1 min左右，至完全混匀。
50%PEG3350 | 1 M LiAc | ssDNA (10 mg/ml) | 文库质粒DNA |
9.6 ml | 1.44 ml | 300 ul | 25 ug |
8). 30℃水浴孵育，30 min。
9). 42℃水浴热激，25 min。
10). 30℃水浴复苏1 h。
11). 离心收菌，室温，4,000 rpm ，5 min，弃上清，用8ml无菌水重悬菌体，尽量温和地混匀，从中取20 ul培养物经梯度稀释后涂SD-TL平板3块，用于检测文库转化效率。其余涂SD-TLH + 5 mM 3AT平板，每块200 ul，共40块。
12). 30℃恒温培养3-4天，观察转化结果，记录转化效率。
13). 根据效率平板的转化子数量，计算筛库效率。
第四部分 影印清除
为了消除受体菌背景生长的干扰，在培养到第3天时，用无菌绒布对筛库平板进行影印清除后，继续培养7-14天。挑取长出的转化子菌落进行下一步检测。
第五部分 阳性克隆鉴定
至影印清除后继续培养7天，从筛库平板中挑取直径大于1.5 mm的单菌落，共挑取到30个初始阳性克隆转化子转接到SD-TL缺陷型平板中继续培
养2-3天。
5.1阳性克隆激活HIS3、ADE2和MEL1报告基因的检测
将上述SD-TL缺陷型平板上长出的30个初始阳性克隆转化子分别用无菌水稀释后点种至SD-TL和SD-TLHA+X-α-Gal缺陷平板上进行HIS3、ADE2和MEL1报告基因检测，30℃恒温培养3-4天。
X-α-Gal平板的配制：将10 mg X-α-Gal溶解在2.5 ml DMF（二甲基甲酰胺）溶液，配制成终浓度为4 mg/ml的X-α-Gal溶液。
在预先配制好的SD-TLHA板上各涂布200 ul X-α-Gal溶液。待X-α-Gal溶液被平板培养基完全吸收后，将转化子菌液进行点板。
对HIS3、ADE2和MEL1报告基因的检测结果显示，阳性对照在SD-TL+X-α-Gal和SD-TLHA都能正常生长并菌落显蓝色，而阴性对照由于不会激活HIS3、ADE2和MEL1报告基因，在SD-TL+X-α-Gal可以正常生长，不能使菌落显蓝色，但在缺少Histidine或Adenine这两种成分的SD-TLHA平板上不能生长。因此，在30个初始阳性克隆中，全部能激活HIS3、ADE2和MEL1报告基因。
第六部分 酵母阳性克隆PCR和测序比对
酵母菌落PCR，20 μl体系如下：
deionized H2O 17.4μl
10×Advantage PCR Buffer 1μl
T7 Amplimer (20μM) 0.4μl
ADR Amplimer (20μM) 0.4μl
50×dNTP Mix (10 mM) 0.4μl
50×Advantage Polymerase Mix 0.4μl
pPR3-N F: 5’ GTCGAAAATTCAAGACAAGG 3’
pPR3-N R: 5’ AAGCGTGACATAACTAATTAC 3’
PCR 程序为：
PCR前5分钟预热PCR仪，PCR反应管每管加入约20μl矿物油。
• 94°C 3 min
• 30 cycles:
94°C 30 sec
68°C 3 min
• 68°C 3 min
• 25°C 1 min
PCR产物电泳检测并测序。
部分阳性克隆检测电泳图（测序结果详见测序文件及excel序列比对结果）
第七部分 回转验证
用含有正确pBT3SUC-XXX诱饵质粒的NMY51酵母转化子作为受体菌制备感受态，将26种阳性克隆分别转化其中，转化方法同上。涂布SD-TL平板。
7.1 阳性克隆回转验证ADE2和HIS3报告基因的检测
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